بررسی ایمنی زایی ژنهای L7/L12 و P39 در موشهای

3000 تومان – خرید نهایی کردن خرید مورد به سبد خرید اضافه شد

هدف از این تحقیق بررسی ایمنی زایی ژنهای L₇/L₁₂ و P39 در موشهای Balac است. بنابراین پس از جداسازی و تکثیر ژنهای فوق مراحل زیر در این تحقیق انجام گرفت.

۱- لکون نمودن ژنهای فوق در یک ناقل انتقال دهنده Cleaning vector

۲- تعیین ترادف نوکلئوتیدی ژنهای جداشده و مقایسه آن با ژنهای L₇/L₁₂

۳- کلون نمودن ژنها در پلاسمید بیان کننده پروکاریونی Procaryotic expression vector

۴- تولید و تخلیص پروتئینهای L₇/L₁₂ و P39

۵- کلون نمودن آنها در پلاسمید بیان کننده اوکاریوتی Eucaryotic expression vector

۶- هاری کردن پلاسمیدهای فوق از آندوتوکسین

۷- تزریق پلاسمیدها، بسویه واکنش و سویه بیماریزا بروسلاآبورتوس به موش Balb/C

۸- سنجشهای ایمونولوژیک

باکتریها و پلاسمیدهایی که برای انجام این پایان نامه استفاده دشه اند بترتیب زیر می باشند:

باکتریها: بروسلاآبورتوس سویه های ۱۹S و ۵۴۴ اشدیشیالکی سویه

اشریشیالکی سویه BL21– اشریشیاکی سویه BL21(DE3(Plyss

پلاسمیرها: PGEX4T1–PRT 28a–SK+(pSK) – Pblue Script-PCDNA3

–        جداسازی کروموزوم بروسلا آبورتوس ۱۹S:

برای تکثیر ج داسازی ژنهای L₇/L₁₂ و P39 ابتدا کروموزوم باکتری جداسازی گردید.

مواد:

بافر TE:

Tris – Hel            ۱۰mm

EDTA                  ۱٫۰mm

‍PH بافر را پس از تهیه برروی ۸ تنظیم می نمائیم.

پروتئیناز K:

CTAB/NaCl:

Nacl                     ۴٫۱gr

CTAB                  ۱۰gr

DDW                            ۱۰۰ml (Final Volume)

روش:

ابتدا محیط برنسط برات را تهیه و استریل نموده و ml5 از محیط را با بروسط آبورتوس سویه ۱۹S تلقیح می نمائیم. پس ۴۸ تا ۷۲ ساعت باکتریها رشد کرده و کدورت مناسبی را پیدا می کند. بقیه مراحل تخلیص کروموزوم بشرح زیر است:

۱- ۵/۱ میلی لیتر از سوسپاستیون فوق را مدت ۲ دقیقه در rpm5000 سانتریفوژ می نمائیم. محلول رویی را دور می ریزیم.

۲- Ml576 از بافر TE را بر روی رسوب باکتری اضافه کرده و رسوب را در بافر حل می نمائیم. سپس ml30 از SDS(10%) و ml3 از پروئیناز K (mg/ml20) را افزوده و بمدت یکساعت در دمای ^۰C37 نگهداری می نمائیم.

۳- پس از مخلوز Ml100 از (M5)NaCl از محلول CTAB/NaCl بمیزان Ml80 اضافه کرده و بمدت ۱۰ دققیق در ^۰C65 انکوبه می کنیم.

۴- هم حجم مخلوط بالا از ترکیب کلروفرم – ایزوآمیل (۱/۲۴) به مخلوط افزوده و سپس از مخلوط بمدت ۵ دقیقه در rpm10000 سانترفوژ می کنیم. محلول رویی را به لوله دیگر منتقل می نمائیم.

۵- هم حجم محلول روئی ترمیب فنل – کلروفرم – ایزوآمیل (۱/۲۴/۲۵) پس از مخلوط بمدت ۵ دقیقه در vpr10000 سانتریفوژ کرده و محلول رویی به لوله دیگری منتقل می نمائیم.